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血管内皮损伤大鼠动物模型的构建,胶体金标识

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-27

核心提示:1 药品与试剂 盐酸肾上腺素 , 氯胺酮, 内皮素-1 浓度试剂盒。2 仪器 HU -12A 透射电镜 , FJ-2011 型r免疫计数器。

核心提示:内皮素-1 ELISA试剂盒日本IBL原装进口,货号:27165日本IBL中国独家代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务内皮素-1 ELISA试剂盒日本IBL原装进口,货号:27165日本IBL中国独家代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务1、前言说明内皮素-1(一种21个氨基酸分子组成的多肽)是目前所知的最有效的血管收缩剂。1985年Rubanyi研究小组发现了一种多肽并将其命名为内皮源性收缩因子,之后Yanagisawa将其分离、测序、克隆,并命名为内皮素,而且认为它是最有效的血管收缩剂,这使得人们了解到它更多的生理功能。内皮素-1是哺乳动物三种血管活性肽家族中的一种,这三种血管活性肽还包括内皮素-2和内皮素-3。这两种相关多肽的2和6号位的氨基酸与ET-1的不同。这些基因可以产生三种前肽,之后可分解成三个含39个氨基酸分子的内皮素分子。我们可以获得一系列内皮素多肽和前肽家族的功能概述和分子生物学知识。ET-1对平滑肌细胞、成纤维细胞有强烈效应,并且它也参与很多疾病过程,特别是心血管疾病。ET-1在充血性心力衰竭、肾衰竭和肺动脉高血压中有重要作用。人的ET-1和牛、犬、鼠、猪、兔和大鼠的ET-1有相同的氨基酸序列。2、日本IBL原装进口,内皮素-1 ELISA试剂盒实验原理此试剂盒是一种夹心法的ELISA试剂盒,整个试剂盒使用了两种高特异性的抗体。TMB作为显色剂,最终溶液所显示的颜色强度与样品中ET-1的量成正比。测量范围:0.78~100pg/ml3、日本IBL原装进口,内皮素-1 ELISA试剂盒应用范围IBL的ET-1 ELISA试剂盒可用于人血清、EDTA血浆、细胞培养液上清和组织提取液中ET-1的定量检测。4、日本IBL原装进口,内皮素-1 ELISA试剂盒试剂盒成分1) 包被板:微孔用抗ET15-21兔IgG包被,96孔。2) 浓缩型酶标抗体:HRP标记的抗ET-1兔IgG Fab片段,30倍浓缩,0.4ml。3) 标准品:ET-1,0.5ml×2。4) EIA缓冲液:内含1%的BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液,30ml。5) 用于稀释酶标抗体的稀释液:内含的1%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液,12ml。6) 显色剂:TMB底物液,15ml。7) 终止液:1N的H2SO4,12ml。8) 浓缩洗涤液:内含0.05%吐温的磷酸缓冲液,50ml。5、日本IBL原装进口,内皮素-1 ELISA试剂盒操作指南A、实验所需器材但试剂盒不提供1) 酶标仪 微量移液器和取样吸头3) 带刻度的量筒与烧杯4) 蒸馏水5) 温育器(37℃±1℃)6) 冷床箱 坐标纸8) 吸水纸9) 用于稀释标准品的试管10) 洗涤瓶11) 酶标抗体稀释的一次性试管12) 提取用的Sep-Pak C-18柱和试剂,见“样品处理应注意的问题”B、试剂准备1) 洗涤液的准备:洗涤液是一种40倍浓缩的缓冲液,使用前应当将洗涤液平衡至室温,并混合均匀。用1950ml蒸馏水稀释50ml浓缩洗涤液,混合均匀,这就是即用型的洗涤液。稀释后的洗涤液应当储存于冰箱中至2周2) 酶标抗体的准备:标记抗体是30倍浓缩的,根据实验所需要的量,用酶标抗体稀释液将浓缩酶标抗体稀释30倍,稀释后就可以用了。例如:如果您检测8孔,则需要800ul即用型的酶标抗体(用870ul酶标抗体稀释液稀释30ul浓缩的酶标抗体,并混合均匀,使用时每孔加100ul)。酶标抗体应当在使用前临时将其准备好。剩余的浓缩酶标抗体应当密封储存于4℃的环境下。3) 标准品的准备:在试管内,用0.5ml蒸馏水稀释标准品,并混合均匀,稀释后ET-1标准品的浓度为200pg/ml。4) 标准品的稀释:为标准品稀释准备9个试管,在每个试管中加入230ul EIA缓冲液。每支试管的具体浓度如下:

核心提示:胶体金标记蛋白A技术(Protein A-gold technique, PAg法) PAg复合物制备方法简便,作为第二抗体,无种属特异性,可以免去不

1 药品与试剂 盐酸肾上腺素 , 氯胺酮, 内皮素-1 浓度试剂盒。

试管1 100pg/ml
试管2 50pg/ml
试管3 25pg/ml
试管4 12.5pg/ml
试管5 6.25pg/ml
试管6 3.31pg/ml
试管7 1.56pg/ml
试管8 0.78pg/ml
试管9 0pg/ml

胶体金标记蛋白A技术(Protein A-gold technique, PAg法) PAg复合物制备方法简便,作为第二抗体,无种属特异性,可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用,蛋白A和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性,又能保持高度的稳定性,PAg复合物分子最小易于穿透组织。PAg复合物的原液在4℃可保存达一年之久。电镜水平的PAg染色法 PAg法在电镜技术的应用原则是二步标记法,可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在:①须1%卵白蛋白-PBs 或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris缓冲液来封闭非特异性的结合部位,而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清,因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合,从而给出假阳性结果;②在应用第一抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时,应用的PBS或TBS的pH应变更为pH8.2。其它可参照本节中包埋后染色法进行。液体配制:1、 胶体金稀释液配方:的0.02mo1/L Tris TBS缓冲液,加入试剂级卵清白蛋白至1%。{免疫电镜按1:20-50稀释,淡红色为适宜稀释液,胶体金稀释后应于当天使用,未用完的应该丢弃。}2、 清洗液: 0.5mol/L,pH7.4 Tris-Hcl缓冲液:Tris,60.57g,1mol/L Hcl约420m1,调pH值至7.4,最后加双蒸水至1000m1,此为储备液。0.05mo1/L Tris缓冲生理盐水:氯化钠8.5-9g;0.5mo1/L,pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1;加双蒸水至1000m1,调pH值至7.4。0.02mo1/LTris缓冲生理盐水:氯化钠8.5-9g;o.5mo1/L,pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1,加双蒸水至l000m1,调pH值至8.2。3、 H2O2的配制:3% H2O24、 8%过碘酸钠水溶液5、 封闭液:前封闭液:1%卵白蛋白—0.05mo1/LTris缓冲液;后封闭液以及胶体金稀释液:1%卵白蛋白—0.02mo1/LTris缓冲液,后封闭为胶体金结合作准备。具体操作:一、包埋:常规电镜制样,样品只需要戊二醛固定,不需要锇酸后固定。丙酮梯度脱水时70%的丙酮中没有添加染色剂。样品于37度烘箱中固化。二、切片:超薄切片厚50~70nm左右,载于300网孔的镍网上。三、抗原修复:1、置1%H2O2内10min至1h(视树脂的硬度和切片的厚度而定),以去锇酸和增进树脂穿透性,有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时,此步可省略。操作时,滴入1%H2O2液1滴于蜡板上,将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片,有主张以1%过碘酸钾代替H2O2的。(同时用8%过碘酸钠水溶液代替双氧水,室温5~25分钟以及丙酮对环氧树脂进行溶解。看三者那个效果最好)2、双蒸水洗3次,每次10min,第1,2次浮于液滴上清洗,第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗,水流应有适当压力,但不宜过高强,用滤纸在网缘将水吸干。三、封闭以及免疫反应:1、载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白-TBS液滴上,室温约1h,阻断非特异性吸附,吸去多余血清,不洗。2、载网直接移至第一抗血清液滴上,在室温孵育2h或4℃18~24h。3、0.05mo1/L TBS pH7.4,洗5min×3次。0.02mo1/L TBS PH8.2,洗5min×3次。1%卵清白蛋白0.02mo1/L TBS 37℃孵育l h,再次阻断非特异性吸附,吸去多余液体,不洗。 4、将PAg原液稀释10~20倍(1:30~1:100,淡红色为适宜稀释液),载网浮于该液滴上,室温孵育10min至1h。5、0.02mo1/L TBS pH8.2,洗5min×3次。0.05mo1/L TBS pH7.4,洗5min×3次。最后切片浸于0.05m01/L TBS pH7.4缓冲液中,送电镜室处理(含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分钟?)。四、电子染色以及电镜观察:1、5%醋酸铀染5min,然后用双蒸水洗。 2、枸橼酸铀染色5min,双蒸水洗净。3、H-600透射电镜观察。免疫胶体金试验成功的要求:抗体高度特异性和亲和力以及被检组织内抗原含量高;标本的前处理和染色也至关重要。取消锇酸后固定,聚合温度不宜高于45度,可以选用37度12小时,45度48小时作为聚合温度。试验全过程应保持网面的湿润。缓冲液要清洁,最好用新鲜配制的或经微孔滤纸过滤后使用。染色前所用器皿必须清洁干净且专用,并用双蒸水冲洗三遍,染色程序中的洗涤必须充分,以减少背景染色。尤其双重免疫标记的切片染色时,第一次金标二抗孵育后必须充分洗涤,以不影响第二次金标二抗的反应结果。摘自:贾云香,卓夏阳,顾云娣.双重胶体金标记的免疫电镜技术.江西医学院学报,2003,43:22-24将免疫组织化学技术与电子显微镜技术相结合,则可以利用电子显微镜高分辨率的优点,在超显微结构水平定位细脑内的特异性抗原。为疾病的病因、发病机理、组织来源等方面的探索研究,为提高疾病的认识与诊断提供可靠的手段。1) 试剂配制:4%多聚甲醛一0.01%戊二醛溶液:多聚甲醛4g,0.2m01/L二甲砷酸钠缓冲液50 m1,20%戊二醛40ul,双蒸水加至100m1。0.5mol/L,pH7.4 Tris-Hcl缓冲液:Tris,60.57g,1mol/L Hcl约420m1,调pH值至7.4,最后加双蒸水至1000m1,此为储备液。0.05mo1/L Tris缓冲生理盐水:氯化钠8.5-9g;0.5mo1/L,pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1;加双蒸水至1000m1,调pH值至7.4。0.02mo1/LTris缓冲生理盐水:氯化钠8.5-9g;o.5mo1/L,pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1,加双蒸水至l000m1,调pH值至8.2。0.5mo1/L,Triton-Tris缓冲生理盐水:Tritonx-100 l0m1;0.5mo1/L,pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1,加双蒸水至l000m1,调pH值至7.4。

2 仪器 HU -12A 透射电镜 , FJ-2011 型r免疫计数器。

将230ul标准品溶液加入到试管1中,混合均匀;之后将230ul试管1中的溶液加入到试管2中,将标准品连续两倍稀释来确定8点标准品(浓度为100pg/ml到0.78pg/ml),EIA缓冲是检测样品空白对照,浓度为0pg/ml。如图:5) 检测样品的稀释:如果有必要稀释的话,用EIA缓冲液稀释检测样品。如果您要用血清、血浆或组织样做样品,有必要用Sep-Pak C-18提取柱进行预提取。(见 “样品处理应注意的问题”)7、日本IBL原装进口,内皮素-1 ELISA试剂盒实验步骤在实验开始大约30分钟时,将所有的试剂都平衡至室温。轻轻的并充分混匀试剂。确保所有试剂都未变质。标准曲线的准备应当与样品的检测同时进行。

2)具体步骤:0.05mo1/L TBS洗5min×3次。1:5正常羊血清37℃孵育l h,阻断非特异性吸附,吸去多余血清,不洗。特异性一抗室温孵育24h。0.05mo1/L TBS pH7.4,洗5min×3次。0.02mo1/L TBS PH8.2,洗5min×3次。1:5正常羊血清37℃孵育l h,再次阻断非特异性吸附,吸去多余血清,不洗。生物素化胶体金标记二抗37℃孵育2h。0.02mo1/L TBS pH8.2,洗5min×3次。0.05mo1/L TBS pH7.4,洗5min×3次。 最后切片浸于o.05m01/L TBS pH7.4缓冲液中,送电镜室处理.

3 实验方法3. 1 动物分组 健康成年SD 大鼠44 只, 雌雄不拘, 体重300±20 g, 由浙江省实验动物中心提供。适应性饲养1 周, 随机分成2 组: 对照组6 只; 血管内皮损伤模型制作组38 只, 其中单纯模型制作组 10 只, 另28 只 在模型制作过程中进行高压氧或高压空气干预。3. 2 模型制作 用生理盐水将1 m g/m l 的盐酸肾上腺素稀释115 倍, 于每天的8: 00、12: 00、16: 00于相同部位皮下注射33.3 Lg /100 g, 连续5 天。对照组在同一时间、同一部位注射等量的生理盐水。3. 3 标本采集 两组动物均于模型制作第6 天晨8: 00, 用氯胺酮按2 m g/100 g 肌肉注射麻醉, 开胸取降主动脉约1~ 2 mm 3 留作电镜标本, 自心脏取血1.5 m l 测定血浆中ET 21 浓度。3. 4 电镜观察 SD 大鼠降主动脉标本经3% 戊二醛-1.5% 多聚甲醛固定4 h 以上 , 磷酸缓冲液 漂洗后, 1% 锇酸后固定2 h , 逐级乙醇2丙酮脱水, 环氧树脂618 浸透, 包埋, 超薄切片经枸橼酸铅、醋酸铀双染色各10 m in, 用HU -12A 透射电镜观察降主动脉内皮细胞结构等变化。3. 5 血浆ET -1 浓度测定 放射免疫分析法。

试剂

皇家赌场号hj85,无DNA酶的胰RNA酶 将胰RNA酶溶解于10mmol/LTris-Hcl,15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的浓度,与100度加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份-20度保存.病毒液体的胶体金技术:(自:傅仓生,胶体金免疫电镜技术用于烟草花叶病毒的检测,植物病理学报,VoL.24,No.4,353—355)1.3.1 外标记标本制备: 以带膜铜网蘸取纯化病毒悬液,PBS冲洗。在相应的抗血清中室温孵育20分钟,PBS冲洗。在PAg中室温孵育20分钟,PBS冲洗。1%醋酸铀负染,H500电镜观察,拍照。内标记标本制备: 以感染烟草花叶病毒的普通烟叶的试料,电镜常规制样,超薄切片。在TMV抗血清中室温孵育l小时,PBS冲洗数次。在PAg中室温孵育1小时,PBS冲洗数次,三蒸水冲洗数次。醋酸铀一柠檬酸铅双染色,H500电镜观察,拍照。(自:翟雷,朴晓萍,潘萍等。微生物学免疫学进展,1995,24:17-19。免疫胶体金试剂的制备及应用胶体金免疫电镜技术检测戊型肝炎病毒)取样品100 ul分别于微量离心管,各加100 ul鼠抗HEV单克隆抗体,混匀, 37℃温箱作用60min,双蒸水充满管,13000 rPm离心30 min,弃上清.沉淀用100 ul双蒸水悬浮,加l00ul胶体金标记免抗鼠IgG,温匀,置37℃温箱作用60 min.双蒸水充满管,13000rPm离心30min,弃上清,沉淀用l00ul双蒸水悬浮,滴于镀膜铜网,干后3%PH7.4的PTA负染,电镜观察。(自:滴一滴NDV于铜网上,室温吸附15分钟,然后用0.1%的PBS洗5次,吸去余液;加一滴金标抗体于铜网上,37度作用20分钟,PBS洗5次,吸去余液,然后用磷钨酸负染5分钟,干燥后电镜观察。(自:梁红,谭红英,蔡景霞等。蛋白A胶体金免疫电镜负染技术检测脊髓灰质炎病毒和SV40病毒,中华微生物和免疫学杂志,1998,9:111-112) 取抗原抗体各50UL在血凝板孔中37度,45分钟。加OD值为0.2胶体金50UL,37度,45分钟。取抗原抗体胶体金混和物50UL,于铜网,室温30分钟。胶体金缓冲液洗两次,双蒸水洗一次,磷钨酸负染,电镜检查。

检测样品

标准品

检测样品对照孔

试剂对照孔

检测样品100ul

稀释标准品100ul

EIA缓冲液 100ul

EIA缓冲液100ul

盖板,4℃下温育一整夜

洗板7次

酶标抗体

100ul

100ul

100ul

-

盖板,37℃下温育30min

洗板9次

显色剂

100ul

100ul

100ul

100ul

室温避光温育30min

终止液

100ul

100ul

100ul

100ul

加终止液后30min内450nm处读取OD值

1) 确定好空白孔,并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。2) 确定好样品对照孔,检测样品孔和标准品孔,然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。3) 盖板,4℃下温育一整夜4) 用洗涤瓶洗板,在微孔中加入洗涤液再浸泡15-30秒,弃取洗涤液。重复7次,最后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时,用洗板机洗四次后,再用洗涤瓶洗3次。5) 每一微孔中加入100ul酶标抗体。6) 盖板,37℃下温育30min7) 按照步骤4)洗板9次8) 将所需量的显色剂加入到试管中,然后每孔内加入100ul显色剂。为了避免污染,请勿将剩余试剂在倒入显色剂原装瓶中。9) 室温避光温育30min,加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色10) 在每一微孔中加入100ul终止液,此时溶液颜色会变成黄色。11) 移去包被孔底的杂质或水滴,同时确保液体表面无泡沫, 30min内在450处读取OD值。8、特别注意1. 样品采集后应立即检测,如需贮存的,则应放置在冰冻条件下,避免反复冻融,检测前应在低温下将其溶解并完全混合2. 如有需要,样品可用EIA缓冲液稀释3. 建议试验样品和标准品做双份检测4. 试验样品应在中性PH范围内,有机溶剂的污染会影响试验5. 只能使用试剂盒内提供的洗涤液洗板,洗板不充足可能会导致试验失败6. 彻底倒去洗涤液,吸水纸上拍干,不能用吸水纸擦拭微孔7. 底物液应避光保存,因其对光敏感,且要避免接触金属8. 加入终止液后30min内读数9、结果计算绘制标准曲线前,将所有的检测孔(包括标准品和未知样品)的OD值都减去检测样品空白孔的OD值。在对数坐标纸上,以标准品的OD值对其相应的浓度,通过这些点作一条平滑的标准曲线。我们可以从标准曲线上读取未知样品的浓度值。典型标准曲线附:采用全自动酶标仪检测,只需检测前设置好酶标仪的相关参数,如坐标参数和计算方式参数(三次回归、四参数或双对数曲线方程),即可直接得到结果10、样品处理应注意的问题直接用于检测的样品所含蛋白浓度低(如细胞培养液上清,尿液等),但是,抽提物中要求高浓度蛋白(如血浆,血清,组织匀浆等),样品抽提建议采用Sep-Pak C-18柱:1. Sep-Pak C-18柱预处理a. 4ml纯乙醇冲洗b. 2ml的去离子水冲洗2次c. 2ml 0.1%的TFA液冲洗2次2.样品预处理a. 血浆-6ml 10%乙酸与2ml血浆混合b. 组织样品组织样品和匀浆内加入1M的乙酸和20mM盐酸溶液煮沸10min后,10000rpm下离心10min,收集上清3. 样品抽提a. 样品加入至Sep-Pak C-18柱b. 3ml去离子水洗柱3次c. 用合适的溶液洗柱收集2ml样品至瓶内4. 检测采集的样品应冻干和冻存,贮存的样品用0.1ml的溶液和0.2ml的EIA缓冲液混合,确保样品PH在中性范围内。样品间的回收率存在不同,请提前做回收试验 产品型号:WAT023501 ,Waters生产 去离子水里加入0.1%的三氟乙酸和60%的乙腈 0.1%三氟乙酸的DMSO 货号:206-10731,日本生产贮存和稳定性贮存条件:2-8℃有效期标记在外盒上本译文仅供参考,详情请以原文为准。中国独家总代理:深圳市科润达生物工程有限公司公司地址:深圳市南山区蛇口沿山路10号6层。邮编:518067联系电话:0755-26814430 传真: 86 755 26814431免费订货电话:800-8306296。技术咨询:座机,0755-26680196;手机,15711973608;E-mail,kerunda@szonline.net。官方网址:www.kerunda.com.cn欢迎索取详细资料,在线Email:kerunda_tech@163.com

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