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抗体格检查测以及杂交瘤细胞的挑选,抗体格检

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-27

核心提示:1 材料 地塞米松磷酸钠注射液 ;RPMI - 1640 培养基 ;RPMI - 1640 培养基 ; 胰蛋白酶 ; 四甲基氮唑盐 ;FLUO-3/ AM ; 二甲基亚砜 ; SOD 与MDA 试剂盒 ;吖啶橙 、溴乙啶 ;酶标仪 ;荧光显微镜 ; 激光共聚焦显微镜 。SD 大鼠 。

核心提示:抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射免疫

核心提示:抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的,而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的,所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下:1.试管溶血反应检测法材料:①杂交瘤细胞,换液后至少两天才收取培养液;②绵羊红血球,洗涤三次后,配成1%悬液;③豚鼠补体,无菌采取补体,以pH7.2PBS稀释成20%溶液,分装小瓶,于��40℃保存。使用时以补体和压积红血球5:1的量进行吸收,4℃30min,然后2 000r/min离心10min,去红血球,取上清液备用;④0.01Mol/L pH7.2PBS液。操作方法:①在小试管中,加入0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液,再加入0.1ml pH7.2的PBS液,然后倍比稀释至一定的稀释度;②加入0.1ml补体和1%绵羊红血球0.1ml,混匀后置37℃水浴1h;③观察结果,以绵羊红血球完全溶解的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价。2.斑点检测法 抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合,进而结合补体,而发生溶血斑点,对着光源用肉眼即可判定。材料:①绵羊红血球,处理同试管法,最后配成25%红血球悬液;②新鲜豚鼠血清;③琼脂糖,配成0.6%PBS液,水浴中溶化;④0.01Mol/L pH7.2PBS液;⑤兔抗羊红血球抗体。操作方法:①将溶化的0.6%琼脂糖倒入一试管中,置45℃~48℃水浴中;②加0.1ml 25%红血球悬液,0.1ml豚鼠补体,迅速混匀,倾注一干净载玻片上;③ 凝固后,在凝胶表面固定区域滴加2ml待测样品,标准阳性血清和对照试液;④待溶液全部渗入凝胶后,置湿盘;⑤37℃温育1h~2h,观察并判定结果。 强阳性 中等阳性 弱阳性 阴性(��)必要时可置室温过夜,再判定一次。3.膜荧光检测法材料:①培养液HEM或RPMI-1640;②荧光试剂:异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠免疫球蛋白;③50%甘油缓冲液:1份甘油加1份体积0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成;④荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。操作方法:①用培养液洗涤二次细胞,悬浮成2.0×107/ml;②50µl细胞悬液加50μl培养上清液混合,置4℃30min,用培养液洗涤3次,1 000r/min离心;③以50µlFITC―抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞,水浴30min~60min;④用冷培养液洗3次细胞,重新悬浮;⑤取一滴细胞悬液滴在玻片上,复盖片,用甘油缓冲液封固,置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后观察,一滴细胞悬液,涂片、风干,用95%酒精固定10min,固定后的载玻片用PBS洗涤,盖上盖玻片,进行观察。4.免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测 以琼脂双扩散试验法进行,此法简单易操作,特异性好。注意必须将培养液浓缩10~50倍,否则做双向琼扩不出现沉淀线。其检测方法为:制备各种兔抗小鼠IgG1~4、 IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清,也可直接购买。取5ml培养物的上清液缓慢加入0.5ml的饱和硫酸铵溶液,混匀,静置3h,离心沉淀,去上清,沉淀加0.05ml蒸馏水溶解。制成1%琼脂糖凝胶板,打孔。中间孔加20μl浓缩上清液,周围孔加20µl特异性抗血清,以10μl正常小鼠血清作对照。也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。杂交瘤细胞的选择经HAT选择培养基培养10~14天,未经融合的骨髓瘤细胞相继死去,而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落。停用HAT液后,改用HT培养基。当细胞集落面积超过培养孔的1/10以上时,即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔。连续三次检测逐渐升高或维持在同一水平者,则可以做克隆化,一部分则冷藏起来做长期保种用。

2 骨骼肌细胞原代培养 取出生1d 的SD 大鼠四肢肌肉,切碎后用37 ℃的消化液 消化两次,每次15min。经Percoll 密度梯度离心后,收集细胞,用Hank′s 液洗两次,199 细胞培养液 悬浮细胞,接种入细胞培养皿。37 ℃培养12h 后收集未贴壁细胞并计数,种入细胞培养板,37 ℃培养 。待细胞生长并融合进行如下实验。

抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的,而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的,所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下:

皇家赌场号hj85,3 细胞增殖测定 设地塞米松大 、中 、小 剂量组,于加药培养后的第24h 从96 孔培养板中吸取100μl 培养上清液,每孔加入25μl 浓度为5mg/mlMTT溶液后,继续培养4h ,吸去旧培养液,再向各孔加入100μl 的二甲基亚砜 100μl ,振荡5min ,等细胞代谢MTT后所形成Formosan 充分溶解后,用酶联免疫检测仪测定490nm 处的吸收度值。

1.试管溶血反应检测法材料:①杂交瘤细胞,换液后至少两天才收取培养液;②绵羊红血球,洗涤三次后,配成1%悬液;③豚鼠补体,无菌采取补体,以pH7.2PBS稀释成20%溶液,分装小瓶,于﹣40℃保存。使用时以补体和压积红血球5:1的量进行吸收,4℃30min,然后2 000r/min离心10min,去红血球,取上清液备用;④0.01Mol/L pH7.2PBS液。操作方法:①在小试管中,加入0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液,再加入0.1ml pH7.2的PBS液,然后倍比稀释至一定的稀释度;②加入0.1ml补体和1%绵羊红血球0.1ml,混匀后置37℃水浴1h;③观察结果,以绵羊红血球完全溶解的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价。

抗体格检查测以及杂交瘤细胞的挑选,抗体格检查测及杂交瘤细胞的精选。4 SOD MDA 测定 于加药培养后的第24h 从96孔培养板中吸取的100μl 培养上清液,按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明进行测定。

2.斑点检测法 抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合,进而结合补体,而发生溶血斑点,对着光源用肉眼即可判定。材料:①绵羊红血球,处理同试管法,最后配成25%红血球悬液;②新鲜豚鼠血清;③琼脂糖,配成0.6%PBS液,水浴中溶化;④0.01Mol/L pH7.2PBS液;⑤兔抗羊红血球抗体。操作方法:①将溶化的0.6%琼脂糖倒入一试管中,置45℃~48℃水浴中;②加0.1ml 25%红血球悬液,0.1ml豚鼠补体,迅速混匀,倾注一干净载玻片上;③ 凝固后,在凝胶表面固定区域滴加2ml待测样品,标准阳性血清和对照试液;④待溶液全部渗入凝胶后,置湿盘;⑤37℃温育1h~2h,观察并判定结果。强阳性 中等阳性 阴性必要时可置室温过夜,再判定一次。

5 形态学方法 将骨骼肌细胞接种于处理过的载玻片上,以1mmol/L地塞米松作用24h 后,分别收集上清细胞及贴壁细胞,加吖啶橙和溴乙锭 / 总细胞数] ×100 %。

3.膜荧光检测法材料:①培养液HEM或RPMI-1640;②荧光试剂:异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠免疫球蛋白;③50%甘油缓冲液:1份甘油加1份体积0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成;④荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。操作方法:①用培养液洗涤二次细胞,悬浮成2.0×107/ml;②50μl细胞悬液加50μl培养上清液混合,置4℃30min,用培养液洗涤3次,1 000r/min离心;③以50μlFITC—抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞,水浴30min~60min;④用冷培养液洗3次细胞,重新悬浮;⑤取一滴细胞悬液滴在玻片上,复盖片,用甘油缓冲液封固,置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后观察,一滴细胞悬液,涂片、风干,用95%酒精固定10min,固定后的载玻片用PBS洗涤,盖上盖玻片,进行观察。4.免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测 以琼脂双扩散试验法进行,此法简单易操作,特异性好。注意必须将培养液浓缩10~50倍,否则做双向琼扩不出现沉淀线。其检测方法为:制备各种兔抗小鼠IgG1~4、 IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清,也可直接购买。取5ml培养物的上清液缓慢加入0.5ml的饱和硫酸铵溶液,混匀,静置3h,离心沉淀,去上清,沉淀加0.05ml蒸馏水溶解。制成1%琼脂糖凝胶板,打孔。中间孔加20μl浓缩上清液,周围孔加20μl特异性抗血清,以10μl正常小鼠血清作对照。也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。

6 钙离子动态变化的测定 用敏感性钙指示剂FLUO-3/ AM,结合激光共聚焦显微镜 检测技术,分析细胞内钙离子的动态变化 。储备的FLUO-3/ AM用D-Hanks液稀释至5μmol/L ,取10μl 加于培养的骨骼肌样品上,置5 %CO2 孵箱中孵育30min。然后用D-Hanks 液洗1 次,再用激光扫描共聚焦显微镜观察FLUO-3/ AM染色的骨骼肌某一层面的萤光图像。取地塞米松10μl 轻轻加入孔中,使终浓度达到1mmol/L,迅速以间隔4s 的速度扫描,计算机记录储存扫描结果, 使用软件为Time Course 及Lasersharp 数据处理软件。

杂交瘤细胞的选择经HAT选择培养基培养10~14天,未经融合的骨髓瘤细胞相继死去,而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落。停用HAT液后,改用HT培养基。当细胞集落面积超过培养孔的1/10以上时,即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔。连续三次检测逐渐升高或维持在同一水平者,则可以做克隆化,一部分则冷藏起来做长期保种用。

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