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肾小管细胞氧化性损伤模型,基因转染实验

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-27

方法:肾小管细胞培养 NRKSIE鼠肾小管细胞 用0.25% 胰蛋白酶消化,将小管细胞分离成单个细胞悬液,用含100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养基,于37℃5%CO2 孵箱中培养。每 24 h更换培养液一次,培养2~3 d,待细胞生长成片备用。

核心提示:核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有1%~5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。 1、配液 2×HBS 1.63g NaCl 1.19g Hepes 0.023g Na2PO4、2H2O 加水至100ml pH7.1过滤,4℃保存 2mmol/L CaCl2 过滤除菌 TE:0.1mmol/L EDTA 1mmol/L Tris-HCL PH8.0 G418液:1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。 G418选择培养基:用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418,G418浓度为200~ 800mg/L 注意:对受体细胞先做预试验,选用浓度为在10~14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。 2、操作步骤[方法一]: 供体DNA制备:方法按前介绍的DNA提取法提取,溶于TE中,40mg/L。 受体细胞的培养:研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等,该细胞有一定自发转化倾向,一般在转染前一天接种细胞,接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液,37℃、5%CO2培养,待细胞占50~70%瓶底面积时,用于转染试验。 DNA-磷酸钙沉淀物的制备 ①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液,同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液220μl和2×HBS 250μl。 ②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中,缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。 ③然后立即混旋,室温下静置30分钟,待溶液轻度混浊后,吹打后即用于转染受体细胞。 转染受体细胞 ①将处于对数生长期已占瓶底50~70%的受体细胞,在转染前4小时更换一次新鲜培养基,每瓶5ml。 ②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀,加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。 ③置37℃ 5% CO2培养24h或更长,使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。 ④更换新鲜培养基,继续培养24小时,诱导转染基因的表达。 ⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。 ⑥培养大约3~5天,对照细胞大部分死亡,这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基,每3~4天更换一次选择培养基。 ⑦2周后对照细胞死亡,在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现,待其增大后再进行化和扩大培养,可建立转化细胞株,并做进一步鉴定。 本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞,这样可使受体细胞获得新霉素基因的抗药性,这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”,也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。若以获取“转化灶”为目的,可不加入PSV2-neo DNA只需将从癌细胞中提取的DNA导入受体细胞即可,其方法如下: 3、DNA转染[方法二]: 配制磷酸转染液 NaCl 8.0g Hepes 5.0g 用时现配,pH很重要一定要控制在6.95±0.65 Na2HPO4 0.099g 消毒灭菌 -20℃贮存备用 加温水至 1000mL 按前面介绍的方法提取癌细胞DNA。 取供体DNA50~100μg,加3M NaCl或醋酸钠,使最终浓度至0.3M混匀。 再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟,去上清。 加入转染缓冲液,待DNA充分溶解后,再加入2.5MCaCl2,含最终浓度为125mM,用吸管轻轻吹打三次,置室温下10~30分钟,待液体透明度降低,出现微浊兰色时,即可用于转染细胞。 取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生长期细胞,在转染前4小时,更换培养液1次。 转染:向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.5~1mL/瓶,置37℃作用4~6小时。 培养:弃去培养液,用15%甘油处理3分钟,无血清培养漂洗1次,接近汇合时血清用量降至5%,培养2~3周。 检测:逐日观察,待出现“转化灶”后,分离,扩大培养建立转化细胞株。脂质体介导DNA转染法脂质体试剂是阳离子脂质体N-[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride和Dioleoyl photidye-thanolamine的混合物[1:1]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时,首先需优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做:第一,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 1、操作步骤[方法一]: :取6孔培养板,向每孔中加入2mL含1~2×105个液,37℃CO2培养至40%~60%汇合时。 转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液A液:用不含血清培养基稀释1-10μg DNA,终量100μL,B液:用不含血清培养基稀释2-50μgLR,终量100μL,轻轻混合A、B液,室温中置10-15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染。 转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入1mL不含血清培养液。 转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。 注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。 2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]皇家赌场号hj85,: 以5×105细胞/孔接种6孔板培养24小时,使其达到50~60%板底面积。 在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下: ①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。 ②旋转1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。 ③室温下放置5~10分钟,使DNA结合在脂质体上。 弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物,37℃培养3~5小时。 再于每孔中加入20

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