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DNA修复系统,DNA抽提指南

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-27

核心提示:10 Fun Facts for DNA Electrophoresis::Migration of DNA is retarded and band distortion can occu

人体内的DNA每天都会受到各种损伤因素的上万次攻击,DNA修复系统会带着各种“工具”抵御它们

核心提示:按照RNA分离操作方案在完全移去水样层后,匀浆中的DNA存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后,DNA溶解在

10 Fun Facts for DNA Electrophoresis

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Migration of DNA is retarded and band distortion can occur when too much buffer covers the gel. The slower migration results from a reduced voltage gradient across the gel.

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Loading DNA in the smallest volume possible will result in sharper bands.

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You can preserve DNA in agarose gels for long-term storage using 70% ethanol. [See Jacobs, D. and Neilan, B.A. BioTechniques 19, 892.]

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Electrophoresing a gel too "hot" can cause the DNA to denature in the gel. It can also cause the agarose gel to deform. Cool the gel with a small fan during the electrophoresis.

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You can preserve DNA in agarose gels for long-term storage using 70% ethanol. [See Jacobs, D. and Neilan, B.A. BioTechniques 19, 892.]

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Electrophoresing a gel too "hot" can cause the DNA to denature in the gel. It can also cause the agarose gel to deform. Cool the gel with a small fan during the electrophoresis.

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For the Supercoiled DNA Ladder electrophoresed on <1% agarose gels, add 2 1lg/ml ethidium bromide to the gel. Otherwise, smeared bands and extra bands will be seen because of different degrees of supercoiling. [See Longo, M.C. and Hartley, J.L. Focus 8:3, 3. .]

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When glycerol-containing loading buffers are used in DNA samples electrophoresed through acrylamide gels, smiling bands may be accentuated especially in TBE.

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On a polyacrylamide gel, DNA fragments having AT-rich regions migrate slower than other DNA fragments of the same size. This anomalous migration is enhanced at lower temperatures and disappears at high temperatures. This anomalous migration is not observed on agarose gels. [See Stellwagen, N.C. Biochemistry22, 6186.]

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The minimum amount of DNA detectable by ethidium bromide on a 3-mm-thick gel and a 5-mm-wide lane is 1 ng. Do not exceed 50 ng of DNA per band on a 3-mm-thick gel and 5-mm-wide lane.

TROUBLESHOOTING DNA AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS

If you see faint or no bands on the gel:

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There was insufficient quantity or concentration of DNA loaded on the gel. Increase the amount of DNA, but don't exceed 50 ng/band.

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The DNA was degraded. Avoid nuclease contamination.

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The DNA was electrophoresed off the gel. Electrophorese the gel for less time, use a lower voltage, or use a higher percent gel.

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Improper W light source was used for visualization of ethidium bromide-stained DNA. Use a shortwavelength W light for greater sensitivity. Note: For preparative gels, using a longer wavelength W light will minimize DNA degradation.

If you see smeared DNA bands:

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The DNA was degraded. Avoid nuclease contamination.

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Too much DNA was loaded on the gel. Decrease the amount of DNA.

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Improper electrophoresis conditions were used. Do not allow voltage to exceed ~20 V/cm. Maintain a temperature <30° C during electrophoresis. Check that the electrophoresis buffer used had sufficient buffer capacity. This is done by checking the pH in the anode and cathode chambers.

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There was too much salt in the DNA. Use ethanol precipitation to remove excess salts, prior to electrophoresis.

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The DNA was contaminated with protein. Use phenol extractions to remove protein prior to electrophoresis.

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Small DNA bands diffused during staining. Add theethidium bromide during electrophoresis.

If you see anomalies DNA band migration:

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Improper electrophoresis conditions were used. Do not allow voltage to exceed ~20 V/cm. Maintain a temperature <30° C during electrophoresis. Check that the electrophoresis buffer used had sufficient buffer capacity.

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The DNA was denatured. Do not heat standards [except for l DNA/Hind III fragments prior to electrophoresis. Dilute DNA standards in buffer with 20 mM NaCl.

DNA修复系统:人体的保护神

按照RNA分离操作方案在完全移去水样层后,匀浆中的DNA存在于中间层和苯酚层中也可以被分离出来。在沉淀和多次洗脱后,DNA溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL试剂从组织和培养细胞中完全回收的DNA可以用来做样品中DNA含量的测定。同时抽提的基因组DNA可以用于对Northern analysis的结果进行标准化,因为DNA变异程度比总RNA或组织重量要小。[由于来源的不同,所得到的DNA沉淀在进一步应用前可能需要额外的纯化步骤。]实验所需但试剂未提供的物品:* 酒精* 0.1 M柠檬酸钠* 75%酒精8 mM NaOH如无例外,以下操作均应在15―30℃下完成。1.DNA的沉淀移除中间层上残余的水样层,用酒精从中间层和苯酚层中沉淀DNA。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加0.3 ml的无水乙醇,反复颠倒来混合样品。然后将样品置于15―30℃下2―3分钟,再在2―8℃下以不超过2,000×g的离心力离心5分钟沉淀DNA。小心移除水样层对抽提的DNA的质量至关重要。2. DNA的洗脱移除离心后苯酚层中的上清液,如有必要,可以将其保留用于抽提蛋白。用0.1 M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀两次。按最初匀浆化时每1 ml TRIZOL加1 ml柠檬酸钠溶液。每次洗涤时洗涤液要和DNA沉淀在15―30℃下作用30分钟再在2―8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。在两次洗涤完成后,用75%的酒精重悬DNA沉淀(每1 ml TRIZOL加1.5―2 ml75%酒精),在15―30℃下放置10―20分钟然后再在2―8℃下以2,000×g的离心力离心5分钟。对于较大的DNA沉淀(> 200 μg)或样品中含有较多的非DNA物质需要用0.1 M柠檬酸钠溶液再洗涤一次。[ www.bbioo.com]3.DNA的再溶解在开口的试管中空气干燥DNA5―10分钟。(不要用离心干燥;它会使得DNA极难溶解。)用8m M的NaOH溶解DNA,大致的比例为0.2―0.3 μgDNA/μl。一般来说,每107个细胞或每50―70 mg组织要加300―600 μl的8m M的NaOH。用弱碱再溶解DNA是高度值得推荐的,因为抽提的DNA在水或是Tris缓冲液中都不能很好再溶解。8m M的NaOH的pH值只有DNA修复系统,DNA抽提指南。~9,一旦DNA溶于其中后可以很容易用TE缓冲液或HEPES再调整其pH值。在本步骤中,DNA样品(尤其是来自组织的样品)可能含有一些不溶解的胶样物质。以>12,000×g的离心力离心10分钟来除去那些不溶的物质。将含有DNA得上清液转移到一新的试管中。溶于8 mM NaOH中的DNA可以在4℃下放置过夜;如果是长期保存,样品中还应该用HEPES将pH值调到7―8并加入1 Mm的EDTA。H值调整好后,dna可以保存于4℃或�C20℃。DNA的定量及预期的产量取一小份溶于8 mM NaOH中的DNA样品,以适当比例和水混合并测量混合液A260值,以双链DNA的A260值计算DNA含量。每一A260单位相当于50μg双链DNA/ml。若以细胞数分析其相应的DNA产量,大致遵循以下比例:每1×106个分别来源于人,大鼠,小鼠的二倍体细胞分别对应于7.1μg, 6.5μg,和5.8μgDNA。应用:通过PCR扩增DNA:在DNA再溶于8mM NaOH后,用0.1 M的HEPES将其pH调到8.4。加0.1到1.0μg的DNA样品到PCR反应体系中并执行标准的PCR反应。

托马斯-林达尔、保罗-莫德里奇和阿齐兹-桑贾尔因在DNA修复细胞机制方面的研究而获得了2015年诺贝尔化学奖,随之,DNA修复系统这个名词进入大众视野,受到人们关注。那么,DNA修复到底是什么呢?

限制性核酸内切酶酶切反应:用HEPES将DNA溶液的pH值调到酶切所要求的范围。作为另一可选方案,也可以用pH值为7―8的1 mM EDTA透析DNA样品。每ug的DNA加3-5单位的酶。酶切条件按照酶制造商的说明进行,反应时间为3―24小时。在标准的测定中,80―90%的DNA是可被消化的。溶于8 mM NaOH中DNA样品pH值的调整:(每1 ml 的8 mM NaOH使用以下数量的0.1 M 或1 M HEPES,游离酸。)

DNA即脱氧核糖核酸,蕴藏着生物体的遗传密码,这也是“龙生龙凤生凤,老鼠的孩子会打洞”的原因。每个人的DNA都不同,让世界上有独一无二的我们,但每一个人体内的DNA应该都是相同的。DNA就像是一个乖宝宝,一直勤勤恳恳地复制着,和其他蛋白小伙伴们在体内创造出了一对又一对和乖宝宝长得一模一样的DNA。

DNA抽提注意事项:皇家赌场号hj85,1.苯酚层和中间层可以在2―8℃下放置过夜。2.溶于75%酒精中的DNA可以在2―8℃下放置数月。3.溶于8 mM NaOH中的DNA可以在2―8℃下放置过夜,若要长期保存,将其pH值调整到7―8,并调整EDTA的浓度到1 mM。疑难解答:DNA抽提•每mg组织或1×106培养细胞预期的DNA产量1.肝和肾,3―4μg2.骨骼肌,脑组织,和胎盘,2―3μg3.培养的人,大鼠,小鼠细胞,5―7μg4.纤维母细胞,5―7μg•产量低1.样品匀浆化或裂解不完全。2.终DNA不完全再溶解。•A260/280比值<1.701.在分光光度计测量前用水而不是用TE缓冲液稀释DNA样品。2.DNA样品中的苯酚没有完全去除。用0.1 M的柠檬酸钠再洗涤DNA沉淀一次。•DNA降解1.从动物身上取下的组织没有立即处理或冰冻。2.用于抽提的样品,或已经抽提的RNA样品存放于-5―-20℃,而没有存放于-60―-70℃。3.使用了Polytron或其他高速的匀浆器匀浆样品。•RNA污染1.水样层没有完全去除。2.用0.1 M的柠檬酸钠洗涤DNA沉淀不完全。•其他的应用方面在行PCR扩增前调整pH值到8.4。对用于限制性核酸内切酶消化的DNA,调整其pH值到所需的范围,每μg的DNA加3―5单位的酶,对某些特殊的酶最佳条件下允许的反应时间在3―24小时内。一般而言,80―90% 的DNA均可以被消化。

DNA修复系统就是人体自带的照顾DNA的修复装备。因为DNA一天里会受到体内体外各种损伤因素的上万次攻击,在DNA受伤后不能继续工作了,DNA修复系统带着它的各种蛋白质、酶等的修复工具赶紧给DNA看病,查明病情是单链断裂还是双链断裂,或是丢了一个小碱基、碱基突变等,再对症下药,实施重连修复手术、重组修复手术、切除修复手术、错配修复手术等。经过DNA修复系统的精心照料,DNA很快就会痊愈并进入到复制工作中了。但是有时候DNA如果伤得不重,做手术会很麻烦,那么DNA修复系统会允许DNA留下小疤痕,不进行大手术,换上跨损伤DNA聚合酶跨过小疤痕,让DNA继续工作。DNA修复系统就是一直照料医治DNA,使其能够一直正常地工作学习。

让我们来盘点一下攻击DNA的坏蛋有哪些。体内坏蛋有细胞内的一些代谢物如氧自由基、复制错误压力等,体外的典型坏蛋是从太阳辐射出的UV射线,还有透视检查的X射线、γ射线、植物毒素、病毒和越来越多的诱变化合物等。总之,想害DNA的坏蛋很多,有时防不胜防,还好人类自带DNA修复装备,要不然可惨了。

DNA修复系统是用来维持整个基因组稳定性、延缓衰老、产生免疫球蛋白多样性、阻止癌症发生等,就是让你的DNA保持正常有序工作,这样你体内一系列通路才会正常,代谢自然也会正常。想象一下,如果人类没有DNA修复系统,倒霉的乖宝宝DNA天天遭遇着上百万次的攻击,它会出现小部件碱基突变、缺失和大框架DNA链断裂,受到严重的伤害。而没有DNA发布指令,体内一切就乱了套,就像是9.5级大地震似的,地崩山摇,毁坏严重,接下来细胞就出现各种死亡。

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