当前位置:皇家赌场号hj85 > 生命科学 > 免疫性PCRAV4的注意事项,免疫性PC路虎极光注意事

免疫性PCRAV4的注意事项,免疫性PC路虎极光注意事

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-27

核心提示:材料与方法1.生物素标记特异性抗体的制备 免疫球蛋白的Fc片段上有糖基存在,因而可用能与糖基

核心提示: 本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联

核心提示:免疫PCR注意事项实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生免疫PCR注意事项实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法,因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合,因此要优化反应条件,以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子,又能结合上DNA。 此外,还可用化学方法将DNA与抗体分子共价偶联,即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的DNA分别用不同的双功能偶联剂激活,然后通过自发的反应偶联到一起,比如,用N-Succinimidyl-S-acetyl thioacetate活化氨基修饰的DNA,用Sulfo-Succinimidyl 4- Cyclohexane-1-Carboxylate修饰抗体分子,然后将二者在一小管中混合,通过加入盐酸胲(Hydroxylamine hydrochloride)使二者偶联在一起。 免疫PCR具有高敏感性。因此,抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了,亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外,应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂,用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染,这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真,重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。 免疫PCR的一个优点是标记DNA序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换,以避免由于污染造成的假阳性信号。 免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此,应用免疫PCR可在微观水平检测抗原,定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量,在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。

免疫性PCRAV4的注意事项,免疫性PC路虎极光注意事项皇家赌场号hj85:。材料与方法1.生物素标记特异性抗体的制备 免疫球蛋白的Fc片段上有糖基存在,因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作生物素标记。 将纯化的抗体(IgM或IgG, 0.1~1.0ml)在标记缓冲液(0.1Mol/L NaAc,pH值5.5, 0.1Mol/L NaCl)中4℃透析过夜。吸取0.5ml至微量离心管中,加过碘酸钠溶液至终浓度为10mMol/L,置冰浴上于暗处孵育30min,使抗体分子上的糖基氧化。将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD-10预装柱,使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide至终浓度5mMol/L,置混摇器上室温孵育1h。用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25预装柱,将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰,保存-20℃。 2.生物素标记DNA片段的制备 作为将与抗体偶联的报告DNA片段,应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列,如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。DNA片段大小为300~500bp,生物素标记可采用PCR方法,根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物,其中一个引物的5’端碱基上带有生物素标记。在0.5mlPCR管中按表将下列试剂混合。表PCR系统组成试 剂 添加量 终浓度10×PCR缓冲液 10.0ul 1×2.5mMol/L 4dNTP混合物8.0ul 0.2mMol/L50uMol/L生物素标记的上游引物1.0ul 0.5uMol/l50uMol/L生物素标记的下游引物1.0ul 0.5uMol/l15mMol/L模板DNA 1.0ul 1.0ugTaq DNA聚合酶1.0ul 5U加水至 100uL 混匀后上面覆盖液体石蜡。95℃加热5min,然后在PCR仪上按下列程序扩增:94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min; 40个循环。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提,然后加10ul 3Mol/L Kac,250uL无水乙醇,置-70℃ 30min。离心沉淀DNA片段,用70%乙醇洗一次。将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中,保存在-20℃。3.制备抗体-亲和素-DNA复合物 将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中,室温孵育30min,再加入两倍分子浓度的生物素标记的DNA片段,继续孵育30min,最后加入10倍分子浓度的生物素,将亲和素分子上的结合部位饱和。最后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开,加入BSA达1mg/ml,分装后冻存于-20℃。4. 免疫PCR按常规ELISA方法,用饱和缓冲液稀释抗原,加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中,4℃过夜。用PBS洗三次,然后每孔加200ul封闭液(PBS含10mg/mlBSA,1mg/ml鱼精DNA),室温孵育30min。用TETBS(其配方:20mMol/L EDTA,0.02%NaN3)洗三次。将抗体-亲和素-DNA复合物稀释于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml鱼精DNA的TETBS中,每孔加50ul,室温孵育1h。用TETBS洗5次,然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。每管中加50ulPCR反应液,含有表成分:试 剂 添加量 终浓度10×PCR缓冲液 5.0μl 1×2.5mMol/L 4dNTP混合物 4.0μl 0.2mMol/L50uMol/L生物素标记的上游引物 0.5μl 0.5μMol/l50uMol/L生物素标记的下游引物 0.5μl 0.5μMol/l15mMol/L MgCl2 5.0μl 1.5μgTaq DNA聚合酶 0.5μl 2.5U加水至 50μL 混匀后上面覆盖液体石蜡。95℃加热5min,然后在PCR仪上按下列程序扩增35个循环:94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。最后72℃延伸10min。每管取5ul作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳,溴化乙锭染色后观察结果,如在PCR时加入了放射性核素标记,则可用X光片显影。亦可在凝胶电泳后做Southern-blot,用特异性探针杂交,进一步提高其特异性和敏感性。

本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法,因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合,因此要优化反应条件,以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子,又能结合上DNA。

皇家赌场号hj85,注意事项 本实验的关键步骤是获得适当的抗体-DNA复合物。用链亲和素将生物素标记的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法,因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合,因此要优化反应条件,以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子,又能结合上DNA片段。 此外,还可用化学方法将DNA片段与抗体分子共价偶联,即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的DNA片段分别用不同的双功能偶联剂激活,然后通过自发的反应偶联到一起,比如,用N-Succinimidyl-S-acetyl thioacetate活化氨基修饰的DNA片段,用Sulfo-Succinimidyl 4- Cyclohexane-1-Carboxylate修饰抗体分子,然后将二者在一小管中混合,通过加入盐酸胲(Hydroxylamine hydrochloride)使二者偶联在一起。免疫PCR具有高敏感性。因此,抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了,亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外,应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂,用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染,这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真,重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。 免疫PCR的一个优点是标记DNA序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换,以避免由于污染造成的假阳性信号。免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此,应用免疫PCR可在微观水平检测抗原,定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量,在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。

此外,还可用化学方法将DNA与抗体分子共价偶联,即将抗体分子和5’端氨基酸修饰的DNA分别用不同的双功能偶联剂激活,然后通过自发的反应偶联到一起,比如,用N-Succinimidyl-S-acetyl thioacetate活化氨基修饰的DNA,用Sulfo-Succinimidyl 4- Cyclohexane-1-Carboxylate修饰抗体分子,然后将二者在一小管中混合,通过加入盐酸胲(Hydroxylamine hydrochloride)使二者偶联在一起。

免疫PCR具有高敏感性。因此,抗体和标记DNA的任何非特异性结合均可导致严重的本底问题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标记DNA被洗掉了,亦可在最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外,应用有效的封闭剂对防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂,用鱼精DNA做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染,这也是所有敏感的检测系统存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真,重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假阳性信号。

免疫PCR的一个优点是标记DNA序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物可经常变换,以避免由于污染造成的假阳性信号。

免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此,应用免疫PCR可在微观水平检测抗原,定量PCR产物可以估计某一标本中的抗原数量,在临床诊断中可在疾病早期抗原量很低时检测到微量的抗原。

本文由皇家赌场号hj85发布于生命科学,转载请注明出处:免疫性PCRAV4的注意事项,免疫性PC路虎极光注意事

关键词: 皇家赌场号hj85