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英在地球刚开始阶段意况模拟条件下合成类奥迪

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-31

核糖核酸与DNA和蛋白质一起是三种主要生物大分子中的一种,可能是早期生命形式中首先出现的。在“RNA世界”假说中,RNA能够独立支持生命,因为它既能存储信息又能催化生化反应。即使在现代生活中,所有细胞中最复杂的分子机器

核心提示:引物的设计合成是PCR技术中最关键且涉及问题最多的的环节之一。鉴于引物设计合成的重要性,我们对可能遇到的问题进

核心提示: 英国化学家13日宣布,他们开发出一个实验模型,可展示40亿年前地球生命如何以一种自我复制的分子形式起源。研究人员在早期地 英国化学家13日宣布,他们开发出一个实验模型,可展示40亿年前地球生命如何以一种自我复制的分子形式起源。研究人员在早期地球环境模拟条件下首次合成了一种中间物质,该物质可纯化合成RNA所需的核糖和碱基,并最终形成一种类RNA。相关研究发表在当日出版的《自然》杂志上。

  • 核糖体 - 主要由RNA构成。维也纳大学化学系和麦吉尔大学的化学家开发出一种新的合成方法,使RNA化学合成的效率比以前高出一百万倍。

引物的设计合成是PCR技术中最关键且涉及问题最多的的环节之一。鉴于引物设计合成的重要性,我们对可能遇到的问题进行了总结。

众所周知,脱氧核糖核酸和核糖核酸是生物体的遗传分子,都由碱基、核糖和磷酸组成。DNA具有双螺旋的复杂结构,而单链的RNA在结构上更为简单和牢固。因此有学者认为,DNA过于复杂,不可能在瞬间突然出现。在生命最初产生时,DNA的单链“表亲”———RNA要先于DNA出现,是地球上最早出现的携带遗传信息的核酸。

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1.引物是如何合成的?

不过,这种“RNA第一”理论,在现实论证中却遇到不少问题。

RNA在细胞中普遍存在。它负责将信息从细胞核中穿出,调节基因表达并合成蛋白质。一些RNA分子,特别是细菌中的RNA分子,也催化生化反应并感知环境信号。

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪,合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪,引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。

RNA包括三个主要组成部分:碱基、核糖和磷酸。在传统思路看来,这三种物质必须分别形成后再以分子的形式相结合才能形成RNA。因此与DNA相比,RNA虽然更为简单,但仍是一个复杂分子,不大可能自行组装成功。此前试图通过化学方式来证明这三种化学物质可以同时产生的努力也均以失败告终。

皇家赌场号hj85,DNA和RNA的化学合成可以追溯到分子生物学的早期,尤其是诺贝尔奖获得者Har Gobind Khorana在20世纪60年代早期为破译遗传密码所做的努力。多年来,由于需要在RNA的核糖的2'-羟基上需要额外的保护基团,因此化学物质已经显着改善,但RNA合成仍然更加困难和缓慢。维也纳大学化学系和麦吉尔大学无机化学系的化学家现已能够将RNA合成向前推进一大步。

亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。

但英国曼彻斯特大学化学家给出了不同解释。由约翰·萨瑟兰教授领导的研究小组大胆提出,通过模拟地球早期环境中的一系列化学反应,可以合成一种重要的中间物质,进而合成类RNA。

为了提高合成效率,化学家们加入了两个关键概念:半导体制造的光刻制造技术和新保护组的开发。

第三步,带帽反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应,用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

实验模型表明,从40亿年前就已在地球上存在的简单化学物质中形成RNA的所有成分是完全可能的,他们已合成了RNA的三个组成部分中的两个,并首次成功合成出一种类RNA。试验先由一种被称为羟基乙醛的简单糖类开始,而后将其与一种氰化物和氨的合成物———单氢胺以及磷酸盐发生反应,从而产生出一种被称为2-氨基噁唑的中间物质。研究人员发现,自然界的昼夜温差可帮助纯化2-氨基噁唑,将其变成充裕的前体,这有助于形成新核苷酸分子的糖和碱基蛋白。磷酸盐的存在和来自太阳的紫外线则促成了合成。

首先,化学家采用来自半导体芯片工业的光刻制造技术,通常用于集成电路制造,用于RNA的化学合成。生物光刻法可以生产密度高达每平方厘米一百万个序列的RNA芯片。研究人员使用UV-A光,而不是使用远紫外线,用于生产用于硅蚀刻和掺杂的计算机芯片。“短波紫外线对RNA具有非常具有破坏性的作用,因此我们在合成中仅限于UV-A光”无机化学研究所的Mark Somoza解释道。

经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。

美国分子生物学家杰克·索斯塔克在《自然》杂志的相关评论中,对该研究给予了高度评价,称这将是多年来通过化学方式解释生命起源研究的一大进展,代表了多年来“前生物化学”研究所取得的重大进展,前生物化学是研究导致地球生物出现的化学进程的术语。

除了光刻技术的创新使用外,研究人员还能够开发出一种新的RNA 2'-羟基保护基团,该基团与光刻合成相容。新的保护基团是缩醛乙酰丙酸酯,其在RNA链延伸中添加的RNA单体之间的偶联反应中也提供非常高的产率。“高合成产率和易处理性的结合使得有可能预见到在微芯片上制备更长,更有功能的RNA分子”,Mark Somoza小组的博士后JoryLiétard说。

通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。

2.引物纯化方式有哪些,如何选择?

C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。

OPC纯化: OPC纯化是根据DNA保护基和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。

PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA 的纯化特别有效。

HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。

3.引物的OD数如何定量?

引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。

4.投诉定量不准是怎么回事儿?

我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告,出现这种情况的可能性有生产人员定量错误。这种可能性有,但是不大,因为我们的生产人员都是经过严格的培训,程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数,因为无论OD数是否达到定单要求,我们都统计为工作量,没有达到OD数的,分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下,引物都有留样。接到用户投诉后,我们都会找出留样重新定量,一般都没有问题。分装没有问题,但引物抽干或收样过程中,引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。系统误差,我们认为10%左右为允许误差。使用过程中,引物工作浓度范围很宽,定量上的少许偏差不影响实验。用户没有能够正确理解引物OD数的含义,没有能够正确使用分光光度计,特别是使用微量测定;用户没有将OD读数,正确地转换成母液中OD数。这种情况比较常见。用户收到引物干粉时,打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。

例如,验证标2OD引物量是否准确,简单的做法是: 加入1ml水,彻底溶解混匀后,取100ul, 加入900ul水,用光径为1cm的石英比色杯,波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。

5.需要什么级别的引物?

引物常用的纯化方式C18脱盐,OPC纯化,PAGE纯化,HPLC纯化。根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用

引物长度要求

纯度级别要求

一般PCR扩增

< 45base

OPC

>45 base

PAGE

诊断PCR扩增

< 40base

OPC, PAGE

DNA测序

20base左右

OPC

亚克隆,点突变等

根据实验要求定

OPC, PAGE,HPLC

基因构建

根据实验要求定

PAGE

反义核酸

根据实验要求定

PAGE

修饰引物

根据实验要求定

PAGE, HPLC

6.最长可以合成多长的引物?

引物越长,出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物,但是产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率,80mer的粗产品,全长引物的百分比不会超过40%,后续处理还有丢失很多,最后的产量是很低。

7.需要合成多少OD数?

根据实验目的确定。一般PCR扩增,2 OD引物,可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了。但是有些研究人员,就做几次PCR,但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低,出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求,其实也是对社会资源的一种浪费,同时也从一个侧面反映了部分研究人员,特别是新手的自信心不足,总觉得需要重复多次才能成功。

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