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细菌总蛋白和膜蛋白提取格局,细胞裂解法

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-27

核心提示:一、反复冻融法:1、将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞一、反复冻融法:1、将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。2、至少3次以上冻溶。3、IFCC推荐法:收集细胞悬液,4℃低温离心(3000rpm,5min),弃上清,加入一定量PBS,轻轻吹打混匀,-200C 冷冻30 min,370C 解冻,如此反复3次,可形成细胞裂解液。4、用液氮冻融三四次就可以了,细胞冻住后,取出放37度水浴,溶解后震荡,再冻二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。3、100ml菌液离心,用8ml缓冲液悬浮,加8mg溶菌酶,冰浴30min,然后超声处理。750W 40%功率。5秒超声,9秒间隔。超声至少90min。4、综合冻融和超声的方法:1500g离心,弃除上清。冰上,用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中,1500g离心浓缩,弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞,并搅拌。可选择:4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl,15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol三、渗透法:冰冷的20 mmol/L Tris-Cl,2.5 mmol/L EDTA处理,冰浴放置10min。《精编分子生物学实验指南》四、裂解液处理法:1、细胞裂解液:50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8,100 mmol/L DTT,2% SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。2、在loading buffer加SDS,100度5分钟,是变性方法。SDS与蛋白等量结合,可以通过条带位移判断蛋白大小,考染不会影响结果。3、如果是做小量菌液,跑PAGE胶看其表达情况的话,可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可,需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟,然后上样时,枪头别吸最底下的。4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA ,4 ml 10% SDS,1 ml 1M Tris-cl,14.96 ml 蒸馏水。5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白,而不考虑包涵体的话,为何要用超声呢?直接水煮不就可以了吗?6、将1ml菌离心弃上清,留大概50ul,再加50ul 2×上样缓冲液,煮10min,取20ul上样,就可以了。7、检测蛋白诱导:从培养的不同时期各取出1ml,12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液(50mM Tris-Cl,100mM DTT,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油)中,100℃加热3min,然后12000g×1min离心。上样15ul,6%SDS-PAGE电泳。《分子克隆》P8268、5-10秒离心,弃除上清,用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF,再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置,然后再溶解,煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。2×SDS上样缓冲液:250mM Tris-Cl,6.2%DTT,8%SDS,0.002%溴酚蓝,40%甘油。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。9、裂解液:50mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。10、我们用NP40(NP40:NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇,是一种非离子表面活性剂。)加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞,冰上放30-60min,然后13000rpm离心15min,取上清定量。11、裂解液配方是:50mmol/L Tirs-HCI ,150mmol/L NaCI,0. 02% 叠氮钠,100μg/ml PMSF,1μg/ml Aprotinin,1% Triton X-100 。12、对于组织培养中生长的细胞,最有效的裂解方法是用去污剂进行处理,溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ,这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。13、细胞裂解液的主要目的:利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;溶解蛋白;蛋白变性使其稳定;抑制蛋白酶活性。推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4,150 mM NaCl,1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA,5 µg/ml Aprotinin,5 µg/ml Leupeptin,1% Triton x-100,1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。14、裂解buffer:50mM HEPES pH7.0,1mM 甘油,1mM DTT,7M 尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),1mM EDTA,1mM PMSF,1mg/ml leupeptin,1mg/ml aprotinin,1mg/ml pepstatin,50mM NaF(anti hemoaggulating),1mM Na3VO4(inhibitor of phosphatases),2mM benzamidine(inhibitor of trypsin)。15、可选择:取0.5ml诱导的细胞并离心2min。弃除上清,用100ul 1×SDS上样缓冲液重悬,冰上放置。6000rpm×10min离心培养物。弃除上清,用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20℃冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15秒、4次超声处理细胞。冰浴降温。4℃,9000g×30min离心。取上清。裂解液:5 mM DTT,15 mM KCl,5 mM MgCl2,50 mM HEPES, pH 7.9,1 mM EDTA,10 mg/ml溶菌酶(临用前加上DTT和溶菌酶)。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞。用含有蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液悬浮沉淀。用100 µg/ml溶菌酶处理并在冰上孵育15 min。加上10% N-laurylsarcosine ,然后超声波破碎。16000 rpm×30 min离心。取上清然后加入Triton X-100至终浓度为2.0%。过Ni-NTA�C琼脂糖柱层析。

核心提示:1、采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞

核心提示: 一、从新鲜样品中提取总蛋白1、自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5

1、采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂,细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化,包涵体的前处理是很重要的。包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上,而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜,使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。1.2.5 DNA片段分析 SGC-7901感染Ad-p27mt和Ad-LacZ 48 h后离心去上清, 在剩余细胞沉淀中加500 mL的细胞裂解液, 37℃下过夜. 然后在101.3 DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 1×106细胞在含50μg/ml顺铂的培养液中培养12h,离心沉淀后,加入细胞裂解液(1% NP40,20mmol/L EDTA pH8.0,50mmol/L Tris-cl pH7.5),离心取上清加入10%SDS、蛋白酶K,50℃孵育2h,再加入RNase A室温放置1h。酚、氯仿抽提,取10μl DNA, 70℃放5min后,15g/L琼脂糖凝胶,4V/cm电泳3h,观察结果并照像保存。

一、从新鲜样品中提取总蛋白

一、反复冻融法:1、将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。

1、自配裂解液(pH 8.5-9.0):50 mM Tris-HCl,2 mM EDTA, 100 mM NaCl,0.5% Triton X-100,调pH值至8.5-9.0备用;用前加入100 μg/ml 溶菌酶,1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。

2、至少3次以上冻溶。

2、将40ml 菌液在12000g,4℃下离心15分钟收集菌体,沉淀用PBS悬浮洗涤2遍,沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。

3、IFCC推荐法:收集细胞悬液,4℃低温离心(3000rpm,5min),弃上清,加入一定量PBS,轻轻吹打混匀,-200C 冷冻30 min,370C 解冻,如此反复3次,可形成细胞裂解液。

3、超声粉碎,采用300w,10s超声/10s间隔,超声20min,反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。

4、用液氮冻融三四次就可以了,细胞冻住后,取出放37度水浴,溶解后震荡,再冻

4、1000g离心去掉大碎片,上清可直接变性后PAGE电泳检测,或者用1% SDS溶液透析后冻存。

二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。

缺点:Western blotting结果表明,疏水性跨膜蛋白提取效率有限。

2、每个样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。

二、从Trizol裂解液中分离总蛋白

3、100ml菌液离心,用8ml缓冲液悬浮,加8mg溶菌酶,冰浴30min,然后超声处理。750W 40%功率。5秒超声,9秒间隔。超声至少90min。

1、Trizol溶解的样品研磨破碎后,加氯仿分层,2-8℃下10000g离心15min,上层水相用于RNA提取,体积约为总体积的60%。

4、综合冻融和超声的方法:1500g离心,弃除上清。冰上,用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中,1500g离心浓缩,弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞,并搅拌。可选择:4℃下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl,15mM的DTT。4℃下111500g×60min离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Alternate Protocol

2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入0.3ml无水乙醇混匀,室温放置3min,2-8℃不超过2000g离心5min。

三、渗透法:冰冷的20 mmol/L Tris-Cl,2.5 mmol/L EDTA处理,冰浴放置10min。《精编分子生物学实验指南》

3、将上清移至新的EP管中,用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入1.5ml异丙醇,室温放置10min,2-8℃下12000g离心10min,弃上清。

四、裂解液处理法:1、细胞裂解液:50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8,100 mmol/L DTT,2% SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。

4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液,室温放置20min, 2-8℃下7500g离心5min,弃上清,重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇,涡旋后室温放置20min,2-8℃下7500g离心5min,弃上清。

2、在loading buffer加SDS,100度5分钟,是变性方法。SDS与蛋白等量结合,可以通过条带位移判断蛋白大小,考染不会影响结果。

5、冷冻干燥5-10min,1%SDS溶液溶解,反复吹打,50℃温浴使其完全溶解,2-8℃下10000g离心10min去除不溶物。

3、如果是做小量菌液,跑PAGE胶看其表达情况的话,可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可,需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟,然后上样时,枪头别吸最底下的。

6、替代方案:将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中,在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次,1000g离心10min去除沉淀,上清可直接用于蛋白实验。

皇家赌场号hj85,4、20毫升细胞裂解液配方:40 μL 0.5M EDTA ,4 ml 10% SDS,1 ml 1M Tris-cl,14.96 ml 蒸馏水。

三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白(Triton X-114去污剂法)

5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白,而不考虑包涵体的话,为何要用超声呢?直接水煮不就可以了吗?

1、配制疏水性蛋白提取液:1% Triton X-114,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,调pH值至8.0备用。

6、将1ml菌离心弃上清,留大概50ul,再加50ul 2×上样缓冲液,煮10min,取20ul上样,就可以了。

2、菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体;用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次,最后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。

7、检测蛋白诱导:从培养的不同时期各取出1ml,12000g×1min离心。将沉淀重悬于100ul 1×SDS上样缓冲液(50mM Tris-Cl,100mM DTT,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油)中,100℃加热3min,然后12000g×1min离心。上样15ul,6%SDS-PAGE电泳。《分子克隆》P8268、5-10秒离心,弃除上清,用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF,再加入50ul热的2×SDS上样缓冲液。迅速混匀后100℃加热3-5min。将样品冰上放置,然后再溶解,煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。2×SDS上样缓冲液:250mM Tris-Cl,6.2%DTT,8%SDS,0.002%溴酚蓝,40%甘油。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。9、裂解液:50mMTris-HCl,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,1mg/ml溶菌酶。

3、菌体沉淀加入1ml冷提取液,于4℃条件下放置2h,17000g离心10min,去除沉淀取上清。

10、我们用NP40(NP40:NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇,是一种非离子表面活性剂。)加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞,冰上放30-60min,然后13000rpm离心15min,取上清定量。

4、将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性,37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。

11、裂解液配方是:50mmol/L Tirs-HCI ,150mmol/L NaCI,0. 02% 叠氮钠,100μg/ml PMSF,1μg/ml Aprotinin,1% Triton X-100 。

5、将液相和去污相分开,分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45min。

12、对于组织培养中生长的细胞,最有效的裂解方法是用去污剂进行处理,溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotinin、1% Triton X-100 ,这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。

6、于4℃条件下17000g离心30min,用去离子水洗涤沉淀3次。

13、细胞裂解液的主要目的:利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;溶解蛋白;蛋白变性使其稳定;抑制蛋白酶活性。推荐RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4,150 mM NaCl,1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂),1 mM EDTA,5 礸/ml Aprotinin,5 礸/ml Leupeptin,1% Triton x-100,1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。

7、将沉淀溶解在1% SDS溶液中,测定蛋白浓度,比较液相和去污相中蛋白提取效率,一般是去污相中疏水性膜蛋白较多,适于进一步蛋白实验。

14、裂解buffer:50mM HEPES pH7.0,1mM 甘油,1mM DTT,7M 尿素,2M硫脲

8、SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。

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