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直接凝集反应手艺,抗体格检查测及杂交瘤细胞

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-27

核心提示:一、概述 原理 可溶性抗原吸附于免疫学反应无关的颗粒表面上,当这些致敏的颗粒与相应的抗

核心提示:凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。本文只叙述直接凝集反应技术。一、概述 颗粒性抗原(细菌、螺旋体

核心提示:抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射抗体检测用检测抗体的方法从杂交细胞中筛选出生产指定抗体的杂交株是很重要的。检测抗体的方法很多,从沉淀反应到放射免疫测定。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的,而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的,所以并不是每项方法都能适用。一定要选择敏感的、快速的、一次又能检测多份样品的方法。常用的检测方法如下:1.试管溶血反应检测法材料:①杂交瘤细胞,换液后至少两天才收取培养液;②绵羊红血球,洗涤三次后,配成1%悬液;③豚鼠补体,无菌采取补体,以pH7.2PBS稀释成20%溶液,分装小瓶,于��40℃保存。使用时以补体和压积红血球5:1的量进行吸收,4℃30min,然后2 000r/min离心10min,去红血球,取上清液备用;④0.01Mol/L pH7.2PBS液。操作方法:①在小试管中,加入0.1ml杂交瘤细胞用过的培养液,再加入0.1ml pH7.2的PBS液,然后倍比稀释至一定的稀释度;②加入0.1ml补体和1%绵羊红血球0.1ml,混匀后置37℃水浴1h;③观察结果,以绵羊红血球完全溶解的杂交瘤细胞培养液的最高稀释倍数为抗体的溶血效价。2.斑点检测法 抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合,进而结合补体,而发生溶血斑点,对着光源用肉眼即可判定。材料:①绵羊红血球,处理同试管法,最后配成25%红血球悬液;②新鲜豚鼠血清;③琼脂糖,配成0.6%PBS液,水浴中溶化;④0.01Mol/L pH7.2PBS液;⑤兔抗羊红血球抗体。操作方法:①将溶化的0.6%琼脂糖倒入一试管中,置45℃~48℃水浴中;②加0.1ml 25%红血球悬液,0.1ml豚鼠补体,迅速混匀,倾注一干净载玻片上;③ 凝固后,在凝胶表面固定区域滴加2ml待测样品,标准阳性血清和对照试液;④待溶液全部渗入凝胶后,置湿盘;⑤37℃温育1h~2h,观察并判定结果。 强阳性 中等阳性 弱阳性 阴性(��)必要时可置室温过夜,再判定一次。3.膜荧光检测法材料:①培养液HEM或RPMI-1640;②荧光试剂:异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠免疫球蛋白;③50%甘油缓冲液:1份甘油加1份体积0.05Mol/L pH 7.2 PBS 液混合即成;④荧光显微镜、载玻片、盖玻片、吸管等。操作方法:①用培养液洗涤二次细胞,悬浮成2.0×107/ml;②50µl细胞悬液加50μl培养上清液混合,置4℃30min,用培养液洗涤3次,1 000r/min离心;③以50µlFITC―抗小鼠免疫球蛋白重新悬浮压积细胞,水浴30min~60min;④用冷培养液洗3次细胞,重新悬浮;⑤取一滴细胞悬液滴在玻片上,复盖片,用甘油缓冲液封固,置荧光显微镜下观察。着色细胞也可以在固定后观察,一滴细胞悬液,涂片、风干,用95%酒精固定10min,固定后的载玻片用PBS洗涤,盖上盖玻片,进行观察。4.免疫球蛋白和亚类球蛋白的检测 以琼脂双扩散试验法进行,此法简单易操作,特异性好。注意必须将培养液浓缩10~50倍,否则做双向琼扩不出现沉淀线。其检测方法为:制备各种兔抗小鼠IgG1~4、 IgM1~2、IgA1~2和K、λ抗血清,也可直接购买。取5ml培养物的上清液缓慢加入0.5ml的饱和硫酸铵溶液,混匀,静置3h,离心沉淀,去上清,沉淀加0.05ml蒸馏水溶解。制成1%琼脂糖凝胶板,打孔。中间孔加20μl浓缩上清液,周围孔加20µl特异性抗血清,以10μl正常小鼠血清作对照。也可以采用酶联免疫吸附试验、间接血凝试验以及放射免疫等方法检测。皇家赌场号hj85,杂交瘤细胞的选择直接凝集反应手艺,抗体格检查测及杂交瘤细胞的挑三拣四。经HAT选择培养基培养10~14天,未经融合的骨髓瘤细胞相继死去,而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落。停用HAT液后,改用HT培养基。当细胞集落面积超过培养孔的1/10以上时,即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔。连续三次检测逐渐升高或维持在同一水平者,则可以做克隆化,一部分则冷藏起来做长期保种用。

一、概述 原理 可溶性抗原吸附于免疫学反应无关的颗粒表面上,当这些致敏的颗粒与相应的抗体相遇时,就会产生特异性的结合,在电解质参与下,这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。 载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。间接凝集反应的优点为:①敏感性强:间接凝集反应是最敏感性的血清学反应方法之一,可以检测到微量的抗体和抗原;②快速:一般1h~2h即可判定结果,若在玻板上进行,则只需几分钟;③特异性强;④使用方便、简单。 载体 具有吸附抗原的载体很多,如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。 良好载体有如下几点基本要求:①在生理盐水或缓冲液无自凝倾向;②大小均匀;③比重与介质相似,短时间内不能沉淀;④无化学或血清学活性;⑤吸附抗原后,不影响其活性。 目前应用最广的是人的O型红血球和绵羊红血球。而后者应用更广,因为其来源方便。另外绵羊红血球的表面有大量的糖蛋白受体,极易吸附某些抗原物质,吸附性能好,且大小均匀一致。 间接凝集的分类 1.根据载体的不同,可分为间接炭凝、间接乳胶凝集和间接血凝等。 2.根据吸附物不同可分为间接凝集反应和反向间接凝集反应。 3.根据反应目的不同,又可分为间接凝集抑制反应和反向间接凝集抑制反应。 4.根据用量和器材的不同又可分为试管法、凹窝板法和反应板法。 二、间接炭凝反应 原理 间接炭凝集反应简称炭凝。它是以炭粉微粒作为载体,将已知的抗体球蛋白吸附于这种载体上,形成炭粉抗体复合物,当炭血清与相应的抗原相遇时,二者发生特异性结合,形成肉眼可见的炭微粒凝集块。 目前炭凝反应已用于炭疽、鼠疫和马副伤寒性流产等病的诊断。 材料与试剂 1.炭粉炭粉粒子最好大小在0.12mm~0.15mm,目前市场上出售的炭粉均不合要求,必须过300目/寸的标准筛以300r/min离心去沉淀,再以3000r/min离心去上清,收集沉淀物。 2.高免血清 3.待测标本 4.灭活兔血清 5.正常血清 6.标准抗原 7.0.05mol/LpH7.2PBS液 8.1%硼酸的PBS液 操作方法 1.炭致敏取湿炭粉0.25g,加入经56℃~60℃灭活30min的稀释高免血清3ml,充分摇匀,置37℃致敏30min,不时摇动,取出后用pH7.2PBS液洗涤3次。最后一次用含1%硼酸和1%兔血清的PBS液洗涤一次,离心去上清,再取此液3ml,混匀即可。同时以正常血清致敏的炭粒处理,以作对照。 致敏血清(加1/万硫柳汞防腐)于室温或4℃冰箱中保存,一年内有效。 2.取洁净玻璃板一块,以玻璃铅笔划成小格,加被检标本0.10ml,再加免疫炭血清0.05ml,充分混匀,静止1min~5min,判定结果。同时设三个对照: ⑴免疫炭血清 标准抗原。 ⑵正常炭血清 标准抗原。 ⑶正常炭血清加待检抗原。

凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。本文只叙述直接凝集反应技术。一、概述 颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应的抗体血清混合后,在电解质参与下,经过一定时间,抗原抗体凝聚成肉眼可见的凝集块,这种现象称为凝集反应。血清中的抗体称为凝集素(Agglutinin),抗原称为凝集原(Agglutinogen)。 细菌或其他凝集原都带有相同的电荷,在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。抗原与抗体相遇后,由于抗原和抗体分子表面存在着相互对应的化学基团,因而发生特异性结合,成为抗原抗体复合物。由于抗原与抗体结合,降低了抗原分子间的静电排斥力,抗原表面的亲水基团减少,由亲水状态变为疏水状态,此时已有凝集的趋向,在电解质参与下,由于离子的作用,中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷,使之失去了彼此间的静电排斥力,分子间相互吸引,凝集成大的絮片或颗粒。出现了肉眼可见的凝集反应。 一般细菌凝集均为菌体凝集,抗原凝集呈颗粒状。有鞭毛的细菌如果在制备抗原时鞭毛未被破坏(鞭毛抗原在56℃时即被破坏),则反应出现鞭毛凝集,鞭毛凝集时呈絮状凝块。 二、玻片凝集反应 玻片凝集反应一般用于未知细菌的定性,所以又称为定性凝集反应。实践中常用于新分离的大肠杆菌和沙门氏菌的鉴定和分型。反过来,也可用已知的细菌抗原去鉴定未知抗体,如鸡白痢沙门氏菌病的清群就是采用已知鸡白痢菌抗原去检测鸡白痢抗体。 材料与试剂 载玻片、已知抗血清、待测细菌等。 操作方法 取洁净载玻片一张,用铂金耳钓取已知诊断血清1滴置于载玻片一端,另端置生理盐水1滴做对照。然后用铂金耳钓取被检细菌少许,置生理盐水滴中研磨混匀,再将铂金耳灭菌后冷却,钓取被检菌少许置于血清滴中研磨混匀。 结果判定 在1min~3min内,血清滴出现明显可见的凝集块,液体变为透明,盐水对照滴仍均匀混浊,即为凝集反应阳性,说明被检菌与已知诊断血清是相对应的。注意如环境温度过低,则可将玻片背面与手背轻轻摩擦或在酒精灯火焰上空拖几次,以提高反应温度,促进结果出现。 三、平板凝集反应 材料与试剂 以布氏杆菌病平板凝集反应为例。 1.玻璃板、刻度吸管等。 2.布氏杆菌平板凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清。 操作方法 1.取洁净玻板一块,用玻璃铅笔划成方格,并注明待检血清号码。 2.取0.2ml吸管分别吸取0.08ml、0.04ml、0.02ml和0.01ml各放入一方格内。大规模检验时,可只做2个血清量,大动物用0.04ml和0.02ml,中小动物用0.08ml和0.04ml。每检一个样品需换一只吸管。 3.每格内加布氏杆菌平板凝集抗原0.03ml,滴在血清附近,而不要与血清接触。用牙签自血清量最小的一格起,将血清与抗原混匀,每份血清用一根牙签。 4.混合完毕,将玻板置凝集反应箱上均匀加温或采用别的办法适当加温,使温度达到30℃左右。3min~5min内记录结果。 结果判定 ++++:出现大的凝集块,液体完全清亮透明,即100%凝集。 +++ :有明显的凝集片,液体几乎完全透明,即75%凝集。 ++ :有可见的凝集片,液体不甚透明,即50%凝集。 + :液体混浊,有小的颗粒状物,即25%的凝集。 - :液体均匀混浊,即不凝集。 以出现++凝集的血清最高稀释倍数作为该份血清的凝集价。大动物以0.02ml出现凝集价判为布氏杆菌病血清阳性,0.04ml出现凝集价判为可疑。中小动物以0.04ml出现凝集价判为该份血清为布氏杆菌病阳性血清,0.08ml出现凝集价判为可疑。

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