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免疫性血清制备方法,动物的挑三拣四与免疫性

文章作者:生命科学 上传时间:2019-08-27

核心提示:多克隆抗体的概念 抗原刺激机体,产生免疫学反应,由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白,这就

核心提示: 免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂,也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体,常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时,则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此,如欲获得高特异性的免疫血清,必须予先纯化抗原。此外,抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等,也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

核心提示:动物的选择 目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最动物的选择 目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广,因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的,雌雄均可,以8~12周龄为宜。 大白鼠也可,能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上,发展了小鼠-大鼠,小鼠-人以及人-人杂交瘤技术。 免疫 一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原。 免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。 正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞,一只纯种小白鼠估计能产生1.0×107~5.0×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合,只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会,必须加强免疫,使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。 B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合,而免疫以后7~8天,虽然是抗体产生的高峰时期,但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。1.可溶性抗原以1mg/ml~5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为0.3ml~0.6ml,间隔3~5周再同样注射一次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉给予无佐剂抗原0.2ml~0.4ml,3~4天后,杀死小鼠取脾做融合用。 2.颗粒性抗原如抗原来源方便,可以不加佐剂而增加免疫次数,缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠,以1%浓度每只皮下注射0.2ml,每周2次,共免疫5~8次,取脾前3天,再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大,大到近于免疫耐受的程度更好。

多克隆抗体的概念 抗原刺激机体,产生免疫学反应,由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白,这就是免疫球蛋白,这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。

一、原理

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的,由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Moncloneantibody)。由多种抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体,机体内所产生的抗体就是多克隆抗体;除了抗原决定簇的多样性以外,同样一类抗原决定簇,也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。

具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别,因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体,实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物。另外,抗体的产生具有回忆应答的规律性,��m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。

免疫动物 供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类,常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的选择常根据抗体的用途和量来决定,也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体,多采用大动物;如要是获得直接标记诊断的抗体,则直接采用本动物;如要获得间接的标记诊断用抗体,则必须用异源动物制备抗体;如果难以获得的抗原,且抗体的需要量少,则可以采用纯系小鼠制备;一般实验室采用的抗体,多用兔和羊制备。

二、免疫方法

免疫性血清制备方法,动物的挑三拣四与免疫性。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物,雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适,有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异,免疫时应同时选用数只动物进行免疫。

根据抗原的性质不同而异。下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。

抗原是多种多样的,而且千差万别。就其化学成分而言,有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言,有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质抗原,如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清,最好选用可降解的蛋白质抗原。不同的抗原,其免疫原性的强弱均不相同,这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。

  1. 用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛,以酒精及碘酒消毒皮肤;

  2. 第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂乳化的抗原下称FCA-IgG)液1ml,每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

  3. 第二次免疫:间隔10-14天后,于两侧 窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG,每个淋巴结注0.1ml,其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时,直接注入两侧 窝及鼠蹊部皮下。

抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。剂量过低,不能引起足够强的免疫刺激,免疫剂量过多,有可能引起免疫耐受。在一定的范围内,抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言,小鼠的首次免疫剂量为50μg~400μg/次,大鼠为100μg~1000μg/次,兔为200μg~1000μg/次。加强计量为首次剂量的1/5~2/5。

4. 间隔7-10天后,从耳静脉采血0.5~1.0ml,分离血清,以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

免疫剂量与注射途径有关,一般而言,静脉注射剂量大于皮下注射,而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大,也可采用淋巴结内注射法。加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小,对家兔而言,采用弗氏完全佐剂,则需注射0.5mg~1mg/kg./次,如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10倍以上。如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。如需要获得高效价的抗血清,宜采用大剂量长程免疫法。免疫周期长者,可少量多次。免疫周期短者,应大量少次。

5. 若效价未达到要求,可用不加佐剂的抗原液耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次,分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后,以弗氏不完全佐剂乳化的抗原再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次,再试血测抗体效价,如效价达到要求立即放血。

两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果,太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般间隔时间应为5~7天,加佐剂者应为2周左右。

三、放血

注射的Ig纯度高,则一般不易引起过敏反应,如注射血清,即使是少量,在再次免疫时,极易引起过敏反应,所以一定要采取措施。

心脏采用血法

佐剂的应用 对可溶性抗原而言,为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的,常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。

  1. 家兔仰面,四肢缚于动物固定架上;

  2. 剪去左胸部兔毛,消毒皮肤;

佐剂的类型目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。1.弗氏不完全佐剂(incompleteFreund’sadjuvant,IFA) 羊毛脂1份 石蜡油5份 混合,高压灭菌后保存。用时加热融化,冷却至50℃左右,加抗原进行乳化处理。

3. 用左姆指摸到胸骨剑突处,食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏,并使心脏固定于左胸侧位置。然后,以左拇指触摸心脏搏动最强的部位;

2.弗氏完全佐剂(completeFreund’sadjuvant,CFA) 弗氏不完全佐剂10ml 卡介苗10mg~200mg

  1. 用50ml注射器,倾针45°角度,对准心搏最强处刺入心脏抽血致死;

  2. 将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中,待凝固后分离血清。

颈动脉放血法

  1. 家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤;

2. 沿颈部中线切开皮肤约10cm,分离皮下组织,直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌;

  1. 分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织,暴露出颈总动脉后使之游离;

4. 于动脉下套入两根黑丝线,分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住;

5. 用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口,插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上,以防放血管滑脱;

  1. 松开血管夹,使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80~100ml。

四、分离血清

将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时,再置4℃冰箱内3~4小时。待血液凝固血块收缩后,用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟,取上清加入防腐剂,分装后置4℃冰箱中保存备用。

五、结果鉴定

以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价,并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量,应产生单一的沉淀弧线。鉴定方法的具体步骤参见有关部分。

皇家赌场号hj85,六、材料

动物:健康成年家兔,雄性,体重2~3公斤。

器材:剪刀、镊子、注射器附针头、称量瓶、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

试剂

  1. 灭菌生理盐水;

  2. 纯化人IgG;

  3. 消毒酒精及碘酒;

  4. 羊毛脂;

  5. 石蜡油;

  6. 活卡价苗;

7. 弗氏不完全佐剂制备:称羊毛脂10克,逐滴加入优质石蜡油40ml,边滴边研磨,分装于疫苗瓶中,高压灭菌后保存备用。

8. 弗氏完全佐剂乳化抗原的制备:将FIA予温,吸取3ml于研钵中,逐滴加入活BCG0.5ml及纯化人IgG2.5ml��_滴入边研磨直至形成均一性的乳状液,取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

七、注意事项

1. 免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大,因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外,不能使用妊娠动物。

2. 免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射,否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后,置于混合器上使之剧烈振荡;后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后,吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。

3. 佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清,但若抗原不纯时,可使抗原中极微量的污染物产生抗体,以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外,有些实验动物种系对BCG过敏,尤其是豚鼠其次是家兔,当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此,第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全佐剂,以减少和防止变态反应的发生。

4. 抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少,免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下,一次注入的总剂量以0.5mg/kg体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大10倍。另外,免疫周期长者可少量多次注射,免疫周期短者可较大量少次注射。

5. 免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射,同时于两侧肩部和鼠蹊部各注一处。每点注0.2ml,间隔2周后再于上述部位选不同点同上注射,也可产生高效价的免疫血清。

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